Κυριακή, 21 Σεπτεμβρίου 2014 07:38

Η λήψη νουκλεϊνικών οξέων από δείγματα ιστών

Γράφτηκε από την
Βαθμολογήστε αυτό το άρθρο
(1 Ψήφος)

Χρήση βιοδειγμάτων FFPE (μπλοκ παραφίνης) για τη μοριακή βιολογική έρευνα

Γράφει η

Δρ Σάββη Μάλλιου Κριαρά

Ειδικός παθολόγος-Ογκολόγος, MD, PhD

Περίπου πριν από ένα αιώνα, αναπτύχθηκε μια εξαιρετική μέθοδος για την διατήρηση δειγμάτων ιστών. Η τεχνική, σταθεροποιεί βιολογικά δείγματα και οι ερευνητές μπορούν να προσθέσουν αντισώματα και ανιχνευτές στο βιολογικό δείγμα.

Διαδικασία επεξεργασίας υλικού για ιστολογική εξέταση

Η πιο κοινή µέθοδος που χρησιµοποιείται για τη µελέτη των ιστών είναι η επεξεργασία από µόνιµα ιστολογικά παρασκευάσµατα που µπορεί στη συνέχεια να µελετηθούν µε τη χρήση διαφόρων µικροσκοπικών τεχνικών.

ΣΤΑ∆ΙΑ ΤΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ

1.     Συλλογή και επεξεργασία δείγµατος

2.     Μονιµοποίηση του ιστού

3.     Επεξεργασία του ιστού (Αφυδάτωση, ∆ιαύγαση, Σκήνωση, Έγκλειση)

4.     Παραγωγή τοµών

5.     Χρώση

6.     Παρατήρηση

Στάδιο
Σκοπός
∆ιάρκεια
 
 
1. ΣΥΛΛΟΓΗ & ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ
Συλλογή, καταγραφή, ταξινόµηση και
 
∆ΕΙΓΜΑΤΟΣ
µακροσκοπική εξέταση του υλικού
 
2. ΜΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ σε απλά ή
∆ιατήρηση µορφολογικής και χηµικής
Περίπου 12 h
 
σύνθετα υλικά
σύνθεσης του ιστού
 
3. ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ του ιστού
 
3α. ΑΦΥ∆ΑΤΩΣΗ σε βαθµιαία
Αφαίρεση του νερού από τους ιστούς και
6-24 h
 
συγκέντρωση αιθυλικής αλκοόλης
τα κύτταρα
 
(30-100%)
 
3β. ∆ιαύγαση σε βενζίνη,
∆ιάλυση του λίπους του ιστού. Αφαίρεση
1-8 h
 
ξυλόλη ή τολουόλη
αλκοόλης και αντικατάστασή της µε
 
διαλύτη που µπορεί να αναµιχθεί µε το
 
3γ. ΣΚΗΝΩΣΗ σε λιωµένη
υλικό σκήνωσης
 
Εµπότιση του ιστού µε ουσία που
0.5–6 h
 
παραφίνη 58-60°C
εισχωρεί σε όλα τα µεσοκυττάρια
 
διαστήµατα αλλά και στα κύτταρα
 
κάνοντας τους ιστούς δύσκαµπτους, άρα
 
. ΕΓΚΛΕΙΣΗ
πιο ανθεκτικούς στο κόψιµο
 
Οι διαποτισµένοι µε παραφίνη ιστοί
 
τοποθετούνται σε ειδικές κασέτες
 
4. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΤΟΜΩΝ
έγκλεισης
 
Οι κύβοι παραφίνης τοποθετούνται σε
 
5. ΧΡΩΣΗ
µικροτόµο για τη παραγωγή τοµών
 
Χρώση των τοµών για να γίνει δυνατή η
 
µικροσκοπική τους παρατήρηση
 

Οι επιστήμονες χρησιμοποιούν κερί παραφίνης για την κοπή, δεδομένου ότι η παραφίνη δεν αναμειγνύεται με το νερό. Τα βιολογικά δείγματα περιέχουν νερό, και οι επιστήμονες αφυδατώνουν τα δείγματα, χρησιμοποιώντας αιθανόλη και ξυλόλη για την απομάκρυνση της αιθανόλης. Για οπτική μικροσκοπία, τα τμήματα παραφίνης είναι συνήθως πέντε μm πάχος. Η παραφίνη δεν είναι αρκετά σκληρή για λεπτότερες τομές.

Η μέθοδος FFPE (μπλοκ παραφίνης) αναπτύχθηκε κυρίως για ιστολογικές εφαρμογές. Σήμερα, υπάρχει μεγάλο ενδιαφέρον για τη χρήση βιοδειγμάτων FFPE για τη μοριακή βιολογική έρευνα.

Χρησιμοποιώντας υψηλής ποιότητας μπλοκ παραφίνης FFPE ιστών βοηθά στην εξεύρεση νέων και καλύτερων θεραπειών για πολλές ασθένειες. Τα FFPE βιοδείγματα (biospecimens) έχουν ευρεία χρήση για την ανακάλυψη φαρμάκων και την βιοϊατρική έρευνα. Σημαντικές εφαρμογές περιλαμβάνουν τη χρήση στην ταυτοποίηση και επικύρωση βιοδεικτών, τη χρήση για γενετικές μελέτες, και την απεικόνιση της δομής των ιστών. Τα εν λόγω δείγματα χρησιμοποιούνται για μελέτες όλων των καρκίνων.

Ένας βασικός στόχος για πολλούς ερευνητές που χρησιμοποιούν δείγματα FFPE ιστών είναι η εξαγωγή υψηλής ποιότητας DNA ή RNA νουκλεϊκών οξέων. Ωστόσο, η επίτευξη καλής ποιότητας, υψηλής καθαρότητας νουκλεϊκών οξέων από τους ιστούς FFPE ιστούς είναι μια πρόκληση, λόγω της διαδικασίας σταθεροποίησης και ενσωμάτωσης. Η Φορμαλδεΰδη προκαλεί εγκάρσια σύνδεση ανάμεσα στα νουκλεϊκά οξέα, καθώς και σε πρωτεΐνες σε κοντινή απόσταση. Δεδομένου ότι αυτό είναι μια χημική αντίδραση, δεν μπορεί εύκολα να αναστραφεί. Περαιτέρω, η παραφίνη που χρησιμοποιείται για την ενσωμάτωση των δειγμάτων πρέπει να αφαιρείται προσεκτικά.

Ευτυχώς,  έχουν αναπτυχθεί  μιας ποικιλία από μεθόδους για την εκχύλιση επιτυχώς των νουκλεϊκών οξέων από δείγματα FFPE (μπλοκ παραφίνης). 

Τυπικά, η διεργασία εκχύλισης αρχίζει με την αφαίρεση της παραφίνης. Αυτό εκτελείται συνήθως με ένα παθητικό τρόπο χρησιμοποιώντας ξυλόλη ή άλλο τύπο διαλύτη για τη διάλυση της παραφίνης. Υπάρχει, επίσης, η λεγόμενη δραστική τεχνική που χρησιμοποιεί ακουστική ενέργεια. Οι υποστηρικτές της μεθόδου αυτής υποστηρίζουν ότι οδηγεί σε ανώτερη ενυδάτωση των ιστών και απόδοση.

Υπάρχουν πολλές τεχνικές εκχυλίσεως νουκλεϊκού οξέος:

  • Μαγνητική DNA αναστρέψιμη μέθοδος δέσμευσης με βάση τα σφαιρίδια (Beckman Coulter)-Magnetic bead-based DNA reversible binding method

Τα νουκλεϊκά οξέα, δεσμεύονται σε μαγνητικά σφαιρίδια. Τα σφαιρίδια διαχωρίζονται και συλλαμβάνονται προϊόντα που πλύθηκαν με ένα διάλυμα αιθανόλης, και μετά  ισοπροπανόλη για την απομάκρυνση προσμείξεων, και μία ακόμη φορά με αιθανόλη, ακολουθούμενη από έκλουση των νουκλεϊκών οξέων από τα μαγνητικά σωματίδια.

  • Στήλες εκχύλισης (QIAGEN και Roche)-Column extraction

Τα νουκλεϊκά οξέα απελευθερώνονται από τις τομές ιστών χρησιμοποιώντας ειδικές συνθήκες λύσης και στη συνέχεια εφαρμόζονται σε μία στήλη ινών υάλου η οποία τα ακινητοποιεί, ενώ οι ξένες προσμίξεις απομακρύνονται.

  • Λύση μόνο (Epicentre βιοτεχνολογία)-Lysis only

Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί καθίζηση άλατος για την εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων. Η τεχνική αυτή οδηγεί σε υψηλότερες αποδόσεις και λιγότερη απώλεια δείγματος, και αποτελέσματα σε μία ώρα.

  • Στερεάς φάσης αναστρέψιμη τεχνολογία δέσμευσης (AZCO)-Plate-based solid-phase reversible binding technology

Χρησιμοποιείται μια στερεά επιφάνεια με αναστρέψιμη δεσμευτική τεχνολογία σε πλάκα, και το DNA και το RNA δεσμεύονται στα τοιχώματα της πλάκας και έτσι απομονώνονται από άλλες πρωτεΐνες, άλατα, κ.ά. Λέγεται ότι είναι η ταχύτερη και λιγότερο δαπανηρή από τις άλλες μεθόδους εκχύλισης νουκλεϊνικών οξέων.

Η μοριακή ανάλυση όγκου είναι ιδανική για εξατομικευμένη θεραπεία

Διαβάστε, επίσης,

Η πικρή αλήθεια για τις χημειοθεραπείες

Γονιδιακή εξατομικευμένη θεραπεία για τον καρκίνο

Πολυφαρμακευτική αντοχή

Bιοψία για τον καρκίνο μέσω του αίματος

Στοχευμένη θεραπεία για τον καρκίνο

H θεραπεία του καρκίνου με αντινεοπλαστόνια

Μοριακό προφίλ του όγκου

www.emedi.gr

Γράφει η
Δρ Σάββη Μάλλιου Κριαρά
Ειδικός Παθολόγος-Ογκολόγος, MD, PhD

 
Διαβάστηκε 1735 φορές Τελευταία τροποποίηση στις Τρίτη, 06 Σεπτεμβρίου 2016 22:09
Σαββούλα Μάλλιου Κριαρά

Αυτή η διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου προστατεύεται από τους αυτοματισμούς αποστολέων ανεπιθύμητων μηνυμάτων. Χρειάζεται να ενεργοποιήσετε τη JavaScript για να μπορέσετε να τη δείτε.